| 摘要 | 本发明涉及一种基于线粒体12S?rRNA基因440bp片段的遗传变异,采用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,鉴定猪、山羊、黄牛、水牛、牦牛5种家畜肉和肉干制品种类的方法,属于生物高技术领域。本发明的鉴定方法包括样本基因组DNA提取,PCR扩增,限制性内切酶消化,酶切产物检测,及样本鉴定的主要步骤。本发明的鉴定方法具有快速、简单、经济、准确的特点,能在新鲜肉类和商品化肉干样本大规模检测中应用。该方法的建立在动物食品检验检疫、防止商业欺诈、建立食品回溯追查系统几方面都具有重要意义。 |
| 主权项 | 一种快速鉴别5种家畜肉类和肉干制品种类的方法,其特征在于本发明方法通过同时扩增猪、山羊、黄牛、水牛、牦牛5种家畜线粒体12S?rRNA基因440bp片段,分析该片段在物种间和种内的核苷酸位点多态性信息,选择AluI和BfaI两种限制性内切酶对PCR产物进行酶切,结果产生物种特异性的酶切片段电泳图谱,实现对5种家畜肉类及肉干制品种类的鉴定；本发明方法的具体步骤如下：(1)使用酚/氯仿法和盐酸胍裂解法提取新鲜肉及肉干制品中基因组DNA；(2)以新鲜肉及肉干制品中提取的基因组DNA为模板,采用已报道的PCR反应引物进行PCR反应：PCR反应体系：总体系为50μL,包含100ng基因组DNA,10mM?Tris-HCl(pH?8.3),2.5mM?MgCl2,50mM?KCl,10pM上下游引物,1U?Taq聚合酶；PCR反应程序：94℃,预变性4min；94℃变性50s,62℃退火50s,72℃延伸60s,重复30个循环；72℃延伸10min；(3)PCR产物检测：取PCR产物2μL在1.0％的琼脂糖上电泳,电泳缓冲液为1×TBE,150V恒压电泳5min,溴乙啶染色5分钟,凝胶成像系统下观察拍照；(4)限制性内切酶消化：10μL?AluI内切酶消化反应体系,包括1μL?PCR反应产物,3U?AluI,1μL酶切缓冲液；37℃酶切6小时。10μL?BfaI内切酶消化反应体系,包括1μL?PCR反应产物,3U?BfaI,1μL酶切缓冲液；37℃酶切6小时；(5)酶切产物分型：取消化产物8μL在10％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳,电泳缓冲液为1×TBE,120V恒压电泳60min,溴乙啶染色10分钟,凝胶成像系统下观察拍照；(6)样品鉴定：根据酶切产物片段长度多态性电泳图谱,各样品的鉴定标准为：AluI内切酶消化：猪肉及其肉干制品,162bp和278bp；山羊肉及其肉干制品,200bp和240bp；黄牛肉及其肉干制品,91bp和349bp；水牛肉及其肉干制品,440bp；牦牛肉及其肉干制品,91bp和349bp；BfaI内切酶消化：猪肉及其肉干制品,30bp、100bp和310bp,其中30bp在10％的聚丙烯酰胺凝胶上较模糊；山羊肉及其肉干制品,130bp和310bp；黄牛肉及其肉干制品,48bp、82bp和310bp；水牛肉及其肉干制品,35bp、130bp和275bp；牦牛肉及其肉干制品,130bp和310bp。 |
; 陈仕毅; 刘益平
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