中国科学院昆明动物研究所机构知识库

脊椎动物神经系统的发育包括神经诱导、图式形成和神经分化三个主要过程。经神经诱导形成的神经板由多种神经前体细胞构成，这些神经前体细胞特异性表达转录因子Sox2，以便维持其细胞多能性。在神经分化阶段，神经前体细胞中的Sox2表达下调，激活Ngnr1-NeuroD1-N-tubulin通路，从而启动神经元的分化过程。新近发现的核蛋白Akirin能够通过表观遗传调控果蝇及小鼠的天然免疫反应，但它在神经系统发育中的功能仍不清楚。在本研究中，我们发现Akirin2参与了非洲爪蛙早期神经前体细胞的维持以及神经元分化过程的调控。敲低Akirin2的表达会引起神经前体细胞增多而抑制神经元分化。在神经前体细胞中，Akirin2与BAF染色质重塑复合物的亚基BAF53a及其互作因子Geminin相互作用，拮抗Geminin对Sox2表达诱导，以便维持适当的神经前体细胞的数目。在分化中的神经元中，Akirin2作为共同转录因子通过影响NeuroD的表达来调控N-tubulin的表达水平，进而参与了神经分化过程的调控。本研究揭示了Akirin2调控早期神经细胞分化的新机制。 泛素连接酶及去泛素化酶，是泛素蛋白酶体系统中的重要组成成分，它们在多种细胞生理过程，如DNA损伤修复中，发挥了重要功能。 去泛素化酶USP7/HAUSP（疱疹病毒相关的泛素特异性肽酶）是肿瘤抑制蛋白p53的关键调控因子，并在基因组稳定性调控和神经发育中具有非常重要的作用。在本研究中，我们发现USP7的蛋白水平受到泛素蛋白酶体信号通路的调控，并筛选到了一个USP7的泛素连接酶Trip12（甲状腺激素受体相互作用因子12）。Trip12可特异性结合USP7，诱导其泛素化与降解。在DNA损伤反应中它能够影响USP7介导的p53及检测点蛋白，如53BP1及Chk1的蛋白稳定。Trip12敲低，会导致G1期细胞增加，这与USP7过表达效应是一致的。相反，Trip12过表达，与USP7敲低一致，都会引起S期细胞增加。因此，我们的研究表明Trip12是USP7的一个泛素连接酶，并在DNA损伤反应中具有重要的调控作用。

Formation of the vertebrate neural system involves multiple processes, including an initial induction of neural tissue from the ectoderm, neural patterning along the dorsal-ventral and anterior-posterior axes, and neuron subtype specification. The initial neuroectoderm (also called neural plate) consists of multipotent neural progenitor cells and these neural progenitors express Sox2, which has been shown to be essential for the maintenance of the multipotency of proliferating neural precursors. Down-regulation of Sox2 is a key step during the transition of cells from proliferating neural progenitors into postmitotic differentiated neurons. A cascade of proneural genes is then activated, thus specifying the neuronal lineage and driving neuronal differentiation. The newly identified nucleoprotein Akirin has been shown to modulate the innate immune response of flies and mice through epigenetic regulation, but its role in neural development remains unknown. Here we show evidence that Akirin2 is involved in both neural precursor maintenance and terminal neural differentiation in Xenopus. Knockdown of Akirin2 results in the proliferation of neural precursors and the inhibition of neuronal differentiation. Akirin2 acts antagonistically to Geminin, thus regulating Sox2 expression, and maintains the neural precursor state by participating in the Brg1/Brm-associated factor (BAF) complex mediated by BAF53a. Additionally, Akirin2 also modulates N-tubulin expression by acting upstream of neuronal differentiation 1 (NeuroD) and in parallel with neurogenin-related 1 (Ngnr1) during terminal neuronal differentiation. Thus, Our results reveal a novel model in which Akirin2 balances neural progenitor self-renewal and neuronal differentiation in Xenopus. E3 ubiquitin ligases and deubiquitinating enzymes (DUBs) are key components of the ubiquitin proteasome system and play critical roles in multiple processes, including DNA damage repair. The deubiquitinating enzyme, USP7/HAUSP (herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease), is a key regulator of the tumor suppressor p53 and plays a major role in regulating genome stability and neural development. Here, we report that the protein stability of USP7 is regulated by the ubiquitin–proteasome pathway. We identified Trip12 (thyroid hormone receptor interactor 12) as a ubiquitin E3 ligase for USP7 and Trip12 targets USP7 for polyubiquitination and proteasome degradation. We also found that Trip12 affects USP7-mediated stabilization of p53 and the checkpoint proteins 53BP1 and Chk1 in response to DDR (DNA damage response). Knockdown of Trip12 leads to an increased cell population in G1 phase, mimicking USP7 overexpression. In contrast, Trip12 overexpression increased the number of cells in intra-S-phase, phenocopying the USP7 knockdown phenotype. Therefore, our data reveal that Trip12 is a ubiquitin E3 ligase for USP7 and has an important modulatory role in the USP7-dependent DDR. 

目 录

第一章 SWI/SNF 染色质复合物调控神经系统发育的研究进展 ...

1 1.1 引言.........................................................1

1.2 ATP 依赖的染色质重塑复合物 SWI/SNF ..........................2

1.2.1 酵母的 SWI/SNF 的发现.................................2

1.2.2 果蝇 BAP 复合物.......................................3

1.2.3 脊椎动物的 BAF 复合物.................................3

1.2.4 SWI/SNF 复合物的进化 .................................4

1.2.5 SWI/SNF 复合物重塑核小体机制 .........................7

1.3 SWI/SNF 复合物与胚胎神经系统发育 ............................7

1.3.1 神经系统发生过程中的 BAF 复合物.......................7

1.3.2 脊椎动物 BAF 复合物与神经管形成......................12

1.3.3 在神经发育过程中，BAF 复合物的转换调控 ..............13

1.3.4 BAF 复合物的相互作用因子 ............................15

1.4 SWI/SNF 复合物与人类疾病 ...................................19

1.4.1 SWI/SNF 复合物与神经功能紊乱相关疾病 ................19

1.4.2 SWI/SNF 复合物与癌症 ................................21

第二章 Akirin 通过 SWI/SNF 复合物调控非洲爪蛙神经系统发育 25

2.1 引言........................................................25

2.2 实验材料与方法..............................................25

2.2.1 实验材料.............................................26

2.2.2 实验方法.............................................28

2.3 实验结果....................................................47

2.3.1 非洲爪蛙 Akirin 相互作用蛋白的筛选与鉴定 ..............47

2.3.2 非洲爪蛙 BAF53a 基因在胚胎发育过程中的时间和空间表达模 式分析......................................................52

2.3.3 BAF53a 参与了 Akirin2 参与的爪蛙胚胎神经系统发育过程 ..54

2.3.4 Akirin2 能挽救 BAF53a Morphant 表型....................55

2.3.5 Akirin2 与 Geminin 直接相互作用........................57

目 录 V

2.3.6 在神经前体细胞中，Akirin2 通过拮抗 Geminin 调节 Sox2 的表达 ............................................................59

2.3.7 在调控爪蛙神经分化过程，Akirin2 作用方式平行于 Ngnr1 ..61

2.4 总结与讨论..................................................63

第三章 蛋白泛素化与 DNA 损伤修复及神经系统疾病 ......... 67

3.1 引言........................................................67

3.2 蛋白泛素化过程..............................................67

3.2.1 蛋白泛素化及去泛素化.................................68

3.2.2 蛋白泛素化修饰的复杂性...............................69

3.3 DNA 损伤位点的泛素化蛋白的募集.............................69

3.3.1 依赖于 RNF8-RNF168 信号途径的泛素化蛋白募集 .........70

3.3.2 RNF8-RNF168 信号途径的调控机制......................72

3.3.3 依赖于其它泛素信号的泛素化蛋白募集...................74

3.4 蛋白泛素化与 DNA 损伤修复通路 ..............................75

3.4.1 蛋白泛素化调控 DNA 损伤位点的末端切除 ...............75

3.4.2 RNF8-RNF168 信号催化的蛋白泛素化的识别决定了 DNA 损伤 修复反应途径................................................76

3.4.3 蛋白泛素化对细胞周期依赖的同源重组修复的调控.........77

3.5 DNA 损伤修复异常与神经系统性疾病...........................79

3.5.1 脊髓损伤（SCI，spinal cord injury） .....................79

3.5.2 阿尔茨海默病（AD，Alzheimer’s disease） ...............79

3.5.3 亨廷顿病（HD，Huntington's disease） ...................80

3.5.4 帕金森病（PD，Parkinson’s disease） ....................80

3.5.5 泛素连接酶 Trip12 及去泛素化酶 USP7 与神经系统性疾病 ..80

第四章 USP7 的泛素连接酶 Trip12 在 DNA 损伤反应中的作用.. 83

4.1 引言........................................................83

4.2 实验材料与方法..............................................85

4.2.1 实验材料.............................................85

4.2.2 实验方法.............................................87

4.3 实验结果....................................................88

4.3.1 细胞内的 USP7 蛋白受到多聚泛素化调控.................89

目 录 VI 4.3.2 泛素连接酶 Trip12 调控 USP7 蛋白水平 ..................89

4.3.3 Trip12 与 USP7 相互作用，并且依赖于 Trip12 的 AWL 结构域及 USP7 的 MATH 结构域........................................92

4.3.4 Trip12 是 USP7 的泛素连接酶 ...........................93

4.3.5 Trip12 介导了 USP7 的多聚泛素化及蛋白酶体途径的降解 ...94

4.3.6 在 DNA 损伤反应中，Trip12 敲低引起 USP7 介导的 p53 及检测 点蛋白的上调，细胞 G2/M 期的停滞............................96

4.4 总结与讨论..................................................98

参考文献 ............................................... 101

致谢................................................... 128

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 ......... 130